Розроблення фармацевтичної композиції протизапальної дії на основі рослинної сировини Cichorium intybus

Abstract

Запалення є важливою реакцією імунної системи, яка забезпечує виживання під час інфекції та пошкодження тканин. Запальні реакції необхідні для підтримки нормального тканинного гомеостазу. Однак регуляція інтенсивності запальної реакції з використанням фармакологічних засобів є важливим елементом лікування багатьох захворювань. В зв'язку з цим проблема розробки нових фармацевтичних композицій на основі пошуку плейотропних ефектів активних фармацевтичних інгредієнтів (АФІ), зареєстрованих у світових фармакопеях, є необхідною та своєчасною. Застосування для цієї мети флавоноїдів як моделей та перспективних кандидатів, а також багатих на них екстрактів з біотехнологічної рослинної сировини, дозволяє вирішувати цілий комплекс проблем та обмежень при лікуванні людей вікової категорії 60+ років. Об'єкт дослідження – процеси формування протизапальних властивостей фармацевтичної композиції у виробництві лікарського засобу на основі біотехнологічної рослинної сировини ("волохатих" коренів) Cichorium intybus. Предмет дослідження – технології комплексного використання флавоноїдів та водно-етанольних екстрактів з біотехнологічної рослинної сировини у виробництві протизапальних геріатричних лікарських засобів. Метою дисертаційної роботи є створення технології фармацевтичної композиції протизапальної дії з керованими фізико-хімічними та фармакологічними властивостями на основі рослинної сировини Cichorium intybus. Отримані в дослідженні наукові результати у сукупності дозволили розв’язати важливе науково-прикладне завдання: створення фармацевтичної композиції протизапальної дії з керованими фізико-хімічними та фармакологічними властивостями на основі фармакопейного флавоноїду діосміну та водно-етанольного екстракту з біотехнологічної рослинної сировини Cichorium intybus. В дисертаційній роботі визначені основні фактори регулювання фармако-технологічних та фармакологічних властивостей протизапального лікарського засобу на основі флавоноїдвмісних АФІ з метою забезпечення нормованих протизапальних властивостей лікарського засобу: природа та фармакологічні властивості флавоноїдів та екстрактів з біотехнологічної рослинної сировини Cichorium intybus, природа та технологічні властивості жирових основ, співвідношення основних компонентів фармацевтичної композиції, технологічні параметри процесу виробництва. Визначено вплив процедури екстракції на вихід біоактивних сполук у "волохатих" коренях Cichorium intybus при використанні двох екстракційних розчинників – води та етанолу (70%). Антиоксидантна здатність, загальний вміст флавоноїдів і відновна здатність отриманих екстрактів були оцінені за допомогою аналізів поглинання радикалів DPPH, хелатування металів та аналізів з відновлення заліза відповідно. Найвищий загальний вміст флавоноїдів, а також найвища антиоксидантна активність і відновна здатність були виявлені в етанольному екстракті порівняно з водним. Встановлено, що загальний вміст флавоноїдів у водному та етанольному екстрактах становив 121,3 мг (RE)/г та 60,3 мг (RE)/г, відповідно. Етанольний екстракт був більш багатим джерелом флавоноїдів, ніж водний. Таким чином, умови екстрагування істотно впливають на загальну кількість біологічно активних сполук в отриманих екстрактах. Показано, що антиоксидантна та відновна активність водного екстракту (EC50 =0,350±0,015 мкг/мл та EC0,5 =0,42±0,04 мг/мл) нижча в 2 і 4 рази, відповідно (вищі значення EC50 та EC0,5 ), ніж ті самі активності етанольного екстракту (EC50 =0,165±0,010 мкг/мл та EC0,5 =0,10±0,01 мг/мл). З використанням надвисокоефективної рідинної хроматографії в поєднанні з мас-спектрометрією високої роздільної здатності (LC-HRMS) в етанольному екстракті з "волохатих" коренях Cichorium intybus ідентифіковано 33 сполуки, включаючи 9 фенольних кислот і 24 флавоноїди, що належать до різних фенольних підкласів. Ідентифіковано прості фенольні кислоти (галова, кавова, хлорогенова, кафтарова) та їх відповідні глікозильовані або складноефірні форми. Апігенін, кверцетин, кемпферол, лютеолін та їх кон'югати (глікозиди, галактозиди, глюкуроніди та ін.) ідентифіковано як основні флавони цього екстракту.Флавоноїди та флавони були переважно у формі O-глікозиду. Двадцять шість основних компонентів екстрактів з "волохатих" коренів Cichorium intybus, включаючи флавоноїди та фенольні кислоти, були кількісно визначені методом HPLC-DAD шляхом порівняння хроматограми екстракту з хроматограмою стандартів у водно-метаноловому розчині. Встановлено, що вміст поліфенолів був значно вищим в етанольному екстракті, ніж у водному, і залежав від властивостей екстрагованих сполук. Вміст кавової кислоти в етанольному екстракті становив 7,001 ± 0,068 мг/г порівняно з 1,013 ± 0,007 мг/г у водному. Концентрація рутину, лютеоліну та апігеніну становила в 38,8, 13,9 і 77,6 разів вище в етанольному, ніж у водному екстракті. Здійснено порівняння впливу діосміну, гесперидину та водно-етанольного екстракту з біотехнологічної рослинної сировини Cichorium intybus на активність ензиму 15-ліпоксигенази як маркера запалення. Показано, що АФІ діосмін та 70%-етанольний екстракт з "волохатих" коренів Cichorium intybus інгібують 15-ліпоксигеназу, при цьому концентрації напівмаксимального інгібування IC50 становлять 244,75±19,91 мкМ та 84,13±7,22 мкМ відповідно. При порівнянні суміші діосміну, гесперидину та 70% етанольного екстракту з "волохатих" коренів Cichorium intybus у співвідношенні 9:1:2 з сумішшю діосміну з 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus (9:1) 5 встановлено, що їхні концентрації напівмаксимального інгібування 15-ліпоксигенази IC50 мають подібні значення (р≥0,05): 69,82±4,56 мкМ та 66,04±6,16 мкМ відповідно. Знайдено, що суміш діосміну з 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus у співвідношенні 9:1 може потенційно використовуватись в якості комплексу активних фармацевтичних інгредієнтів для лікарських засобів протизапальної дії, оскільки має високу ефективність як інгібітор 15-ліпоксигенази. Концентрація напівмаксимального інгібування 15-ліпоксигенази IC50 в даних умовах становить 66,04±6,16 мкМ. Розроблено оригінальний лікарський засіб ДЦ, супозиторії ректальні по 500 мг з активними фармацевтичними інгредієнтами діосміном (450 мг) та 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus (50 мг). Показано, що кількісний склад і технологія виробництва лікарського засобу ДЦ, супозиторії ректальні по 500 мг є оптимальними, що підтверджується в процесі напрацювання лабораторних серій і контролю проміжних продуктів. Розроблено лабораторний регламент приготування лікарського засобу ДЦ, супозиторії ректальні по 500 мг з урахуванням вимог належної виробничої практики GMP, який включає лабораторну рецептуру, опис технологічного процесу, технологічну схему із зазначенням критичних стадій та параметрів контролю в процесі виробництва. Доведено відсутність хімічних взаємодій (хімічну сумісність) компонентів розробленого лікарського засобу та стабільність системи в умовах прискореного випробування протягом 6 місяців. Зроблено висновок, що при розробці складу фармацевтичної композиції на основі діосміну та етанольного екстракту з "волохатих" коренів Cichorium intybus здійснено раціональний підбір допоміжних речовин та технології її виготовлення. В дисертаційній роботі шляхом визначення впливу структури та властивостей АФІ флавоноїдної природи діосміну, гесперидину та етанольного екстракту з “волохатих” коренів Cichorium intybus на інгібування 15-ліпоксигенази концептуально обґрунтовані склад та технологія фармацевтичної композиції, яка забезпечує високий показник протизапальних властивостей на рівні концентрації напівмаксимального інгібування 15-ліпоксигенази IC50 = 66,04±6,16 мкМ. При цьому вперше встановлено: - що гесперидин є активатором 15-ліпоксигенази (Ka=933,77±98,44 мкМ) і, таким чином, потенційно володіє прозапальними властивостями; - що 70%-етанольний екстракт з "волохатих" коренів Cichorium intybus майже в 3 рази є більш ефективним інгібітором 15-ліпоксигенази, ніж діосмін; - ефект підвищення протизапальної ефективності фармацевтичної композиції при застосуванні суміші діосміну з 70% етанольним екстрактом з “волохатих” коренів Cichorium intybus у співвідношенні 9:1, в порівнянні з протизапальною ефективністю індивідуальних АФІ з дослідженої суміші у порівнянних концентраціях; - молекулярний механізм інгібування 15-ліпоксигенази діосміном, 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus та їх сумішшю:модель Mixed (Partial), тобто змішаного (часткового) типу інгібування, коли інгібітор зв’язується як у активному центрі ензиму, так і зовні, а ензим-субстратний комплекс зберігає часткову активність у порівнянні з нативним ензимом; - що суміш діосміну з 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus у співвідношенні 9:1 може використовуватись в якості комплексу активних фармацевтичних інгредієнтів для лікарських засобів протизапальної дії. Практична значимість роботи полягає у розробленні та впровадженні в науково-дослідний процес фармацевтичної розробки лабораторної технології протизапальної фармацевтичної композиції на основі суміші діосміну з 70% етанольним екстрактом з "волохатих" коренів Cichorium intybus, що розширює можливості вітчизняної фармацевтичної промисловості у створенні нових лікарських засобів для лікування запальних захворювань. Лабораторна технологія одержання та дослідження властивостей екстрактів з біотехнологічної рослинної сировини Cichorium intybus впроваджена на підприємстві ТОВ "Ковлар Груп". Результати дослідження біологічної активності екстрактів з біотехнологічної рослинної сировини Cichorium intybus впроваджено в освітній процес кафедри аптечної технології ліків Національного фармацевтичного університету для здобувачів вищої освіти за ОПП "Фармація" на другому (магістерському) рівні вищої освіти.

Inflammation is a crucial immune system response that ensures survival during infections and tissue damage. Inflammatory reactions are necessary to maintain normal tissue homeostasis. However, regulating the intensity of the inflammatory response using pharmacological agents is an important element in treating of many diseases. Therefore, the development of new pharmaceutical compositions based on the search for pleiotropic effects of active pharmaceutical ingredients (APIs) registered in global pharmacopeias is necessary and timely. The use of flavonoids for this purpose as models and promising candidates, as well as rich extracts from biotechnological plant raw materials containing them, allows addressing a whole range of problems and limitations in treating individuals aged 60 and above. The object of the study is the processes of forming anti-inflammatory properties of a pharmaceutical composition in the production of a medicinal product based on biotechnological plant raw material ("hairy" roots) of Cichorium intybus. The subject of the study includes technologies for the comprehensive use of flavonoids and aqueous-ethanol extracts from biotechnological plant raw material in the production of anti-inflammatory geriatric medicinal products. The aim of the dissertation work is to create a technology for obtaining a pharmaceutical composition with controlled physicochemical and pharmacological properties, exhibiting anti-inflammatory effects, based on plant raw material Cichorium intybus. The scientific results obtained in the research collectively allowed to solve an important scientific-applied task: creating a pharmaceutical composition with anti-inflammatory effects and with controlled physicochemical and pharmacological properties based on the flavonoid included in the pharmacopoeia diosmin and an aqueous-ethanol extract from biotechnological plant raw material Cichorium intybus. In the dissertation work, the main factors regulating the pharmaco-technological and pharmacological properties of the anti-inflammatory medicinal product based on flavonoid-containing APIs were identified with aimed of ensuring standardized anti-inflammatory properties of the medicinal product, considering the nature and pharmacological properties of flavonoids and extracts from biotechnological plant raw material Cichorium intybus, as well as the nature and technological properties of lipid bases, the ratio of the main components of the pharmaceutical composition, and the technological parameters of the production process. The influence of the extraction procedure on the yield of bioactive compounds in the "hairy" roots of Cichorium intybus when using two extraction solvents - water and ethanol (70%) was determined. Antioxidant capacity, total flavonoid content, and reducing capacity of the obtained extracts were evaluated using DPPH radical scavenging, metal chelation, and iron reduction assays, respectively. The highest total flavonoid content, as well as the highest antioxidant activity and reducing capacity, were found in the ethanolic extract compared to the aqueous extract. The total flavonoid content of the aqueous and ethanol extracts was found to be 121.3 mg (RE)/g and 60.3 mg (RE)/g, respectively. The ethanolic extract was a richer source of flavonoids than the aqueous extract. Thus, the extraction conditions significantly affect the total amount of biologically active compounds in the obtained extracts. It was shown that the antioxidant and reducing activity of the aqueous extract (EC50 =0.350±0.015 μg/ml and EC0.5 =0.42±0.04 mg/ml) is 2 and 4 times lower, respectively (higher values of EC50 and EC0.5 ) than the same activities of the ethanolic extract (EC50 =0.165±0.010 μg/ml and EC0.5 =0.10±0.01 mg/ml). Using ultra-high-performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS), 33 compounds, including 9 phenolic acids and 24 flavonoids belonging to different phenolic subclasses, were identified in the ethanolic extract from the "hairy" roots of Cichorium intybus. Simple phenolic acids (gallic, caffeic, chlorogenic, kaftaric) and their corresponding glycosylated or ester forms were identified. Apigenin, quercetin, kaempferol, luteolin and their conjugates (glycosides, galactosides, glucuronides, etc.) were identified as the main flavones of this extract. Flavonoids and flavones were mainly in the O-glycoside form. Twenty-six major components of Cichorium intybus "hairy" root extracts, including flavonoids and phenolic acids, were quantified by HPLC-DAD by comparing the chromatogram of the extract with the chromatogram of standards in aqueous-methanol solution. It was established that the content of polyphenols was significantly higher in the ethanol extract than in the water extract, and it depended on the properties of the extracted compounds. The content of caffeic acid in the ethanol extract was 7.001 ± 0.068 mg/g compared to 1.013 ± 0.007 mg/g in the aqueous extract. The concentration of rutin, luteolin, and apigenin was 38.8, 13.9, and 77.6 times higher in the ethanol than in the aqueous extract. A comparison of the impact of diosmin, hesperidin, and aqueous-ethanol extract from biotechnological plant raw material Cichorium intybus on the activity of the enzyme 15-lipoxygenase as a marker of inflammation was conducted. It was demonstrated that the APIs diosmin and 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus inhibit 15-lipoxygenase, with half-maximal inhibitory concentrations (IC50 ) of 244.75±19.91 µM and 84.13±7.22 µM, respectively. When comparing the mixture of diosmin, hesperidin, and 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus in a ratio of 9:1:2 with the mixture of diosmin with 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus (9:1), it was established that their half-maximal inhibitory concentrations (IC50 ) for 15-lipoxygenase have similar values (p≥0.05): 69.82±4.56 µM and 66.04±6.16 µM, respectively. It was found that the mixture of diosmin with 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus in a ratio of 9:1 can potentially be used as a complex of active pharmaceutical ingredients for anti-inflammatory medicinal products, as it exhibits high effectiveness as an inhibitor of 15-lipoxygenase. The half-maximal inhibitory concentration (IC50 ) for 15-lipoxygenase under these conditions is 66.04±6.16 µM. An original medicinal product, DC 500 mg suppositories, has been developed, containing 450 mg of diosmin and 50 mg of 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus as active pharmaceutical ingredients. It has been demonstrated that the quantitative composition and manufacturing technology of the medicinal product DC 500 mg rectal suppositories, are optimal, as confirmed during the development of laboratory batches and intermediate product control. A laboratory procedure for preparing the medicinal product DC 500 mg rectal suppositories, has been developed, considering the requirements of Good Manufacturing Practice (GMP). This procedure includes the laboratory formula, a description of the technological process, and a technological scheme specifying critical stages and control parameters during production. The absence of chemical interactions (chemical compatibility) among the components of the developed medicinal product and the system's stability under accelerated testing conditions for 6 months have been proven. It is concluded that a rational selection of excipients and the manufacturing technology has been made in the development of the pharmaceutical composition based on diosmin and ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus. In the dissertation work, by determining the influence of the structure and properties of active pharmaceutical ingredients (APIs) of flavonoid nature, namely diosmin, hesperidin, and ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus, the composition and technology of a pharmaceutical composition have been conceptually justified which ensures a high index of anti-inflammatory properties at the level of half-maximal inhibitory concentration (IC50 = 66.04±6.16 µM) for the inhibition of 15-lipoxygenase. Moreover, for the first time, it has been established that: - hesperidin is an activator of 15-lipoxygenase (Ka=933.77±98.44 µM) and, therefore, potentially possesses pro-inflammatory properties; - the 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus is almost three times more effective as an inhibitor of 15-lipoxygenase than diosmin; - there is an enhancement in the anti-inflammatory effectiveness of the pharmaceutical composition when a mixture of diosmin with 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus in a ratio of 9:1 is used, compared to the anti-inflammatory effectiveness of individual APIs from the investigated mixture at comparable concentrations; - the molecular mechanism of inhibition of 15-lipoxygenase by diosmin, 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus, and their mixture follows a Mixed (Partial) model, indicating a mixed type of inhibition. In this model, the inhibitor binds both at the active site of the enzyme and externally, maintaining partial activity in the enzyme-substrate complex compared to the native enzyme; - the mixture of diosmin with 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus in a ratio of 9:1 can be utilized as a complex of active pharmaceutical ingredients for anti-inflammatory medicinal products. The practical significance of the work lies in the development and implementation of pharmaceutical technology for the production of an anti-inflammatory pharmaceutical composition based on a mixture of diosmin with 70% ethanol extract from "hairy" roots of Cichorium intybus. This expands the possibilities of the domestic pharmaceutical industry in creating new medications for the treatment of inflammatory diseases. The laboratory technology for obtaining and studying the properties of extracts from biotechnological plant raw material Cichorium intybus has been implemented at the enterprise «Kovlar Group» LLC. The research results regarding the biological activity of extracts from biotechnological plant raw material Cichorium intybus have been incorporated into the educational process of the Department of Pharmaceutical Technology of Drugs at the National Pharmaceutical University for students pursuing higher education in the Pharmacy field at the second (master's) level of higher education.